PCR产物快速构建重组杆状病毒的方法及相关功能蛋白的研究

【摘要】昆虫杆状病毒载体表达系统是应用最为广泛的真核表达系统之一。对于BmNPV病毒载体系统来说，传统的同源重组构建重组病毒的方法存在重组效率低、技术复杂且耗时费力的问题，即使通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒也需要约2周左右的时间。本研究拟构建一种快速构建重组病毒的方法，无需多步克隆和筛选，操作简单方便、周期短。本研究是在已构建的复制缺陷型BmNPV穿梭载体RD-BmBacmid基础上进行研究的。首先，合成与RD-BmBacmid有50bp同源的DNA片段：左重组臂RA-L、右重组臂RA-R，然后与目的基因通过重叠PCR得到含有50bp同源臂的PCR产物。该PCR产物与线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫，一步产生重组病毒，无需筛选。本研究中目的基因是AcGFP和DsRed两种荧光蛋白报告基因。重叠PCR扩增出含有50bp同源臂的PCR产物（AcGFP-DHA和DsRed-DHA），再与线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞，可以观察到细胞病变和荧光，表明重组病毒表达了相应的目的蛋白。同时该方法也适用于家蚕幼虫，可以观察到转染后的蚕体因表达相应荧光蛋白而变绿或变红。在进一步探究PCR产物快速构建重组杆状病毒机制中，发现杆状病毒LEF-3和AN分别是Red同源重组中的Beta和Exo蛋白的同源物，故克隆并表达纯化LEF-3和AN蛋白以及体外实验验证其功能。本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒的方法，操作简单，省时省力，且能快速表达外源蛋白，为杆状病毒载体系统的应用提供了新的方法。
【作者】梅文枫；
【导师】陈健；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】RD-BmBacmid；共转染；荧光蛋白；LEF-3；AN；Red重组；

【参考文献】
[1]ATAMBALINDAH（琳达）.China in Africa; Partner or Opportunist[D].山东大学,国际关系,2013,硕士.
[2]滕祥泉.非比例阻尼空间结构弹性动力有限元时程分析[D].天津大学,港口、海岸及近海工程,2004,硕士.
[3]沈子清.纳米磁性壳聚糖吸附剂的制备及其性能研究[D].上海交通大学,环境科学与工程,2014,硕士.
[4]吴统茂.胡椒碱对大鼠急性脊髓损伤后神经保护作用的量效关系及作用机理研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[5]董瑞春.采煤机螺旋滚筒煤岩石截割的数值模拟技术研究[D].辽宁工程技术大学,机械制造及其自动化,2012,硕士.
[6]吴佳楠.东北抗日联军第一军的斗争及地位[D].沈阳师范大学,中共党史,2014,硕士.
[7]韩月.基于稀疏性的机器学习方法研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[8]马洪伟.“网络反腐”的法治化研究[D].淮北师范大学,法学理论,2014,硕士.
[9]何紫薇.财务杠杆、债务期限结构与企业投资相关关系的研究[D].重庆工商大学,会计学,2014,硕士.
[10]唐璞.论我国网络自拍隐私权的私法保护[D].西南大学,民商法学,2014,硕士.
[11]杨志伟.AZ80镁合金汽车轮毂锻造成形数值模拟及实验研究[D].燕山大学,机械工程,2014,硕士.
[12]刘畅.国内商业银行汽车行业供应链金融服务研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[13]赵小康.混合分数布朗运动环境下的权证定价[D].华中科技大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[14]姜宏民,严丹,李华钧,雷云霞.走出节能建筑名不符实的怪圈积极推进北方采暖地区全方位建筑节能[J].住宅产业.2006(04)
[15]侯伟.从晚清和制汉字新词的传播看中日文化交流[D].南京航空航天大学,日语语言文学,2013,硕士.
[16]杨厚祥.目前农村高中德育存在的问题分析及对策思考[D].华中师范大学,学科教学论,2003,硕士.
[17]李宏毅,施正荣.太阳能光伏发电技术(17)[J].建筑创作.2005(07)
[18]钱晓龙.金属薄管电磁膨胀成形局域化破坏过程实验研究[D].宁波大学,机械电子工程,2013,硕士.
[19]付昕.与文物建筑相关的建筑设计[D].清华大学,建筑学,2002,硕士.
[20]孙进.源于英语的汉语构词成分的认知研究[D].湖南师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[21]游晓良.非线性TMD系统对斜拉桥振动控制研究[D].中南林业科技大学,结构工程,2013,硕士.
[22]陈奇薇.我国上市公司财务舞弊处罚的审计师反应研究[D].杭州电子科技大学,会计学,2013,硕士.
[23]王秋华.大连三洋制冷的企业竞争力分析[D].辽宁工程技术大学,企业管理,2004,硕士.
[24]李渭龙.碳纳米管多维多尺度杂化结构的可控制备和形成机理研究[D].西北大学,2011.
[25]柳国松,汪建华,熊礼威.MPCVD法在镍基底上低温沉积石墨烯的研究[J].真空与低温,2014,04:224-229.
[26]王红,李锦秋,陆音.数字图书馆信息资源整合模式的研究[J].科技情报开发与经济,2005,07:41-42.
[27]陶桂宝.基于DNC软插件技术集成化生产管理系统研究与实践[D].重庆大学,2003.
[28]何柳.欧盟反倾销调查中非市场经济地位问题研究[D].中国政法大学,比较法学,2013,硕士.
[29]潘发达.大学生情绪归因的特点及其与气质的关系研究[D].上海师范大学,发展与教育心理学,2004,硕士.
[30]朱红蕾,李明.一种高效维护关联规则的增量算法[J].计算机应用研究,2004,09:107-109.
[31]陈晨.CO_2流体—沉凝灰岩、凝灰质砂岩相互作用的实验研究[D].吉林大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[32]谭民,疏松桂.具有参数跟踪自适应观测器的故障检测与诊断系统[J].自动化学报,1992,02:193-198.
[33]郭沛.新型混合油—纸板绝缘的热老化特性及其在配电变压器中应用[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[34]葛艳秋.基于DNA功能化纳米信标的电化学免疫传感方法研究[D].大连理工大学,2014.
[35]关敏丽.高科技消费品交易障碍成因及对策研究[D].西北工业大学,西方经济学,2004,硕士.
[36]云美厚.《石油地球物理物探》——我的良师益友[J].石油地球物理勘探,2005,03:258.
[37]孙文腾.面向药物知识发现的天然产物—靶标预测网络模型研究[D].华东理工大学,计算机技术,2013,硕士.
[38]高广.挖掘数据资源,提高决策能力[J].世界电信,2005,07:46-48.
[39]巩志鹏.供销合作社发展中的政府行为研究[D].内蒙古师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]谭锦彪.遍历平面内Partial-Order线段集的ESP求解算法研究[D].大连海事大学,软件工程,2013,硕士.
[41]岳昊.基于CFD改进升力法的两栖车轴流泵设计[D].大连理工大学,船舶与海洋结构物设计制造,2013,硕士.
[42]郑婷.重庆五大功能区的经济发展差异性测度及预测[D].重庆大学,应用统计学（专业学位）,2014,硕士.
[43]温大吉.X公司品牌工程建设研究[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[44]苏航.化工企业环境风险评价与突发环境事件应急预案研究[D].浙江大学,2014.
[45]刘江.激光三角法板材厚度在线测量仪的研究与设计[D].重庆大学,光学工程,2014,硕士.
[46]周蕊.信息技术与语文教学相整合的研究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[47]杨悦.基于内容的多媒体检索系统[D].天津大学,2003.
[48]刘香.公共财政视角下的甘肃省基础教育均等化问题研究[D].兰州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[49]黄雅莉.曼哈顿维尔音乐课程对我国中小学音乐教育的启示[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[50]邢全道.高地隙窄形橡胶履带轮水旱兼用宽幅植保施肥机的设计与性能试验[D].南京农业大学,农业机械化工程,2013,硕士.